小RNA测序

产品介绍

Small RNA是一大类调控分子，包括miRNA、siRNA、snoRNA、piRNA和rasiRNA等。其中，miRNA是一大类调控分子，包括miRNA、siRNA、snoRNA、piRNA和rasiRNA等。其中，miRNA是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA分子，其在细胞内主要通过降解mRNA、抑制翻译、调控异染色质形成等途径参与调控生物体的生长发育和疾病发生。每个miRNA可以有多个靶基因，几个miRNA也可以靶向同一个基因，从而形成复杂的调控网络。

应用方向

癌症研究

miRNA在癌症的发生以及发展过程中发挥重要的作用。miRNA可以通过其他媒介分子，如circRNA、lncRNA等参与调节癌症相关基因的表达，从而参与调控癌症的发生和发展。借助Small RNA测序可以鉴定与癌症发生相关的miRNA,从而指导癌症发病机制的研究，指导癌症的诊断以及药物的研发。

其它疾病研究

miRNA在心血管疾病、糖尿病、中风等多种疾病中扮演重要的角色，具有很强的疾病特异性。因此，通过Small RNA测序可以寻找具有调控作用的miRNA以及miRNA的靶基因，揭示miRNA在各种疾病中的作用机制，指导预后诊断以及药物的研发。

生长发育研究

研究发现，miRNA广泛参与调控细胞分化、器官形成、个体发育等基本生命活动，具有很强的器官以及发育特异性。通过Small RNA测序可以发现更多与生长发育过程相关的miRNA，揭示miRNA在生长发育过程中的作用机制。

技术参数

样本类型

RNA、血液、血清、血浆、组织、细胞、FFPE样本（注：如需使用FFPE样本进行转录组测序请联系明码生物科技技术支持）

送样要求

样本类型	送样要求
冰冻新鲜组织	新鲜组织≥5mg，立即切成<0.5cm的碎块，浸没在5倍体积的RNAlater中，4°C过夜。-80°C保存，干冰运输。
FFPE组织	3~5张FFPE切片，4~5um，0.6mm3。请提供H&E染片。FFPE切片常温运输。
细胞	细胞量≥5×10⁵，收集好的细胞离心后，PBS缓冲液洗两遍，立即加入1mlTrizol裂解。-80°C保存，干冰运输。
血液	总量≥2.5ml，采用PAXgen Blood RNA tube收集血液样本，混匀。-80°C保存，干冰运输。
血浆/血清	总量≥2.5ml，抗凝管：柠檬酸钠管或EDTA管，不建议肝素抗凝管。加入TRIZOL LS裂解血浆/血清，与样本比例为3:1。-80°C保存，干冰运输。
Total RNA	RNA溶解于TE buffer中，总量≥1.1µg，浓度≥50ng/μL，体积≥10μL。RIN≥8.0

测序平台和数据量

测序平台：Illumina HiSeq X10
测序模式：PE 150
测序数据量：10M reads以上

服务周期

实验周期

1.24个样本以内，30个工作日
2.25-50个样本，50个工作日
3.超过50个样本，询期

标准生物信息分析周期

1.20个样本以内，15个工作日
2.50个样本以内，20个工作日
3.100个样本以内，30个工作日
4.超过100个样本，询期

实验流程

图1 Small RNA测序实验流程

生物信息分析流程

图2 生物信息分析流程

重要分析结果展示

图3 Small RNA长度分布统计
（x轴代表Small RNA长度，y轴代表reads数目）

图4 Clean reads与Rfam数据库比对情况统计
（利用Rfam数据库对测序所得的Small RNA进行注释，包括各种RNA分子的占比，如rRNA、scRNA、snoRNA和tRNA等）

图5 新miRNA二级结构预测
（左上角为miRDeep2预测的miRNA的信息，包括新miRNA名称、可靠性打分、比对counts等信息。右上方为新miRNA的发卡结构，红色为mature区，黄色为loop区，紫色为star区。中间的密度分布图展示map到该miRNA的序列分布情况，横轴为miRNA所在前体的序列信息，纵轴为各碱基位置的reads的频率。下面的具体比对情况代表mature和star的丰度分布，obs则表示实际观察到的测序数据情况（as observed from the sequencing data）；exp表示期望的酶切情况（as expected from Drosha/Dicer processed sequence）；known表示已知的miRNA序列的信息；reads表示实际检测到的序列数目，mm表示错配数目，并且错配位点用大写字母表示）

图6 miRNA差异表达分析
(x轴代表miRNA的差异倍数，y轴代表差异的显著性；红色点表示表达显著上调的 miRNA，蓝色点表示表达显著下调的miRNA；灰色点表示无显著差异的miRNA)

经典案例解析

利用Small RNA测序发现急性缺血性中风的生物标志物

研究人员对20位急性缺血性中风（IS）患者和20位健康人（HC）的血浆样本进行Small RNA测序，鉴定到32个差异表达（FDR<0.05）的miRNA。随后，研究人员利用qRT-PCR在40位IS患者和40位HC的验证样本，以及200位IS患者、100位HC和72位短暂性脑缺血（TIA）患者的重复样本中进一步验证出有三个miRNA（miR-125a-5p、miR-125b-5p 和 miR-143-3p）的表达量在IS患者中显著上调(图7)。此外，研究人员发现这三个miRNA主要来源于血小板。通过受试者工作特性曲线（ROC Curve)分析，研究人员发现miR-125a-5p、miR-125b-5p 和 miR-143-3p的曲线下面积（AUC）大于其他蛋白标志物（图8A-C），可以很好的区分IS患者和HC人群。但是在IS患者和TIA患者中，这三个miRNA的AUC为0.663，而三个miRNA和蛋白标志物组合的AUC为0.661，不能显著区分IS患者和TIA患者（图8D）。

图7 实验设计以及miRNA的鉴定

图8 miRNA生物标志物性能评估