产品介绍
Small RNA是一大类调控分子,包括miRNA、siRNA、snoRNA、piRNA和rasiRNA等。其中,miRNA是一大类调控分子,包括miRNA、siRNA、snoRNA、piRNA和rasiRNA等。其中,miRNA是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA分子,其在细胞内主要通过降解mRNA、抑制翻译、调控异染色质形成等途径参与调控生物体的生长发育和疾病发生。每个miRNA可以有多个靶基因,几个miRNA也可以靶向同一个基因,从而形成复杂的调控网络。
应用方向
癌症研究
miRNA在癌症的发生以及发展过程中发挥重要的作用。miRNA可以通过其他媒介分子,如circRNA、lncRNA等参与调节癌症相关基因的表达,从而参与调控癌症的发生和发展。借助Small RNA测序可以鉴定与癌症发生相关的miRNA,从而指导癌症发病机制的研究,指导癌症的诊断以及药物的研发。
其它疾病研究
miRNA在心血管疾病、糖尿病、中风等多种疾病中扮演重要的角色,具有很强的疾病特异性。因此,通过Small RNA测序可以寻找具有调控作用的miRNA以及miRNA的靶基因,揭示miRNA在各种疾病中的作用机制,指导预后诊断以及药物的研发。
生长发育研究
研究发现,miRNA广泛参与调控细胞分化、器官形成、个体发育等基本生命活动,具有很强的器官以及发育特异性。通过Small RNA测序可以发现更多与生长发育过程相关的miRNA,揭示miRNA在生长发育过程中的作用机制。
技术参数
样本类型
RNA、血液、血清、血浆、组织、细胞、FFPE样本 (注:如需使用FFPE样本进行转录组测序请联系明码生物科技技术支持)
送样要求
样本类型 送样要求
冰冻新鲜组织 新鲜组织≥5mg,立即切成<0.5cm的碎块,浸没在5倍体积的RNAlater中,4°C过夜。-80°C保存,干冰运输。
FFPE组织 3~5张FFPE切片,4~5um,0.6mm3。请提供H&E染片。FFPE切片常温运输。
细胞 细胞量≥5×105,收集好的细胞离心后,PBS缓冲液洗两遍,立即加入1mlTrizol裂解。-80°C保存,干冰运输。
血液 总量≥2.5ml,采用PAXgen Blood RNA tube收集血液样本,混匀。-80°C保存,干冰运输。
血浆/血清 总量≥2.5ml,抗凝管:柠檬酸钠管或EDTA管,不建议肝素抗凝管。加入TRIZOL LS裂解血浆/血清,与样本比例为3:1。-80°C保存,干冰运输。
Total RNA RNA溶解于TE buffer中,总量≥1.1µg,浓度≥50ng/μL,体积≥10μL。RIN≥8.0
测序平台和数据量
测序平台:Illumina HiSeq X10
测序模式:PE 150
测序数据量:10M reads以上
服务周期
实验周期
1.24个样本以内,30个工作日
2.25-50个样本,50个工作日
3.超过50个样本,询期
标准生物信息分析周期
1.20个样本以内,15个工作日
2.50个样本以内,20个工作日
3.100个样本以内,30个工作日
4.超过100个样本,询期
实验流程
图1 Small RNA测序实验流程
生物信息分析流程
图2 生物信息分析流程
重要分析结果展示
图3 Small RNA长度分布统计
(x轴代表Small RNA长度,y轴代表reads数目)
图4 Clean reads与Rfam数据库比对情况统计
(利用Rfam数据库对测序所得的Small RNA进行注释,包括各种RNA分子的占比,如rRNA、scRNA、snoRNA和tRNA等)
图5 新miRNA二级结构预测
(左上角为miRDeep2预测的miRNA的信息,包括新miRNA名称、可靠性打分、比对counts等信息。右上方为新miRNA的发卡结构,红色为mature区,黄色为loop区,紫色为star区。中间的密度分布图展示map到该miRNA的序列分布情况,横轴为miRNA所在前体的序列信息,纵轴为各碱基位置的reads的频率。下面的具体比对情况代表mature和star的丰度分布,obs则表示实际观察到的测序数据情况(as observed from the sequencing data);exp表示期望的酶切情况(as expected from Drosha/Dicer processed sequence);known表示已知的miRNA序列的信息;reads表示实际检测到的序列数目,mm表示错配数目,并且错配位点用大写字母表示)
图6 miRNA差异表达分析
(x轴代表miRNA的差异倍数,y轴代表差异的显著性;红色点表示表达显著上调的 miRNA,蓝色点表示表达显著下调的miRNA;灰色点表示无显著差异的miRNA)
经典案例解析
利用Small RNA测序发现急性缺血性中风的生物标志物
研究人员对20位急性缺血性中风(IS)患者和20位健康人(HC)的血浆样本进行Small RNA测序,鉴定到32个差异表达(FDR<0.05)的miRNA。随后,研究人员利用qRT-PCR在40位IS患者和40位HC的验证样本,以及200位IS患者、100位HC和72位短暂性脑缺血(TIA)患者的重复样本中进一步验证出有三个miRNA(miR-125a-5p、miR-125b-5p 和 miR-143-3p)的表达量在IS患者中显著上调(图7)。此外,研究人员发现这三个miRNA主要来源于血小板。通过受试者工作特性曲线(ROC Curve)分析,研究人员发现miR-125a-5p、miR-125b-5p 和 miR-143-3p的曲线下面积(AUC)大于其他蛋白标志物(图8A-C),可以很好的区分IS患者和HC人群。但是在IS患者和TIA患者中,这三个miRNA的AUC为0.663,而三个miRNA和蛋白标志物组合的AUC为0.661,不能显著区分IS患者和TIA患者(图8D)。
图7 实验设计以及miRNA的鉴定
图8 miRNA生物标志物性能评估
参考文献
Tiedt S, Prestel M, Malik R, et al. Seq Identifies Circulating miR-125a-5p, miR-125b-5p and miR-143-3p as Potential Biomarkers for Acute Ischemic Stroke[J]. Circulation Research, 2017:CIRCRESAHA.117.311572.