产品介绍
10x Genomics推出的免疫谱解决方案(The Chromium Single Cell Immune Profiling)可以同时检测几百至数万个T细胞和B细胞的多态性以及基因表达情况,揭示细胞多样性、抗原特异性和细胞组分等,为免疫组学研究提供扩展性平台。
该技术利用油包水微滴的核酸barcode分配系统,通过微流体技术,将barcode分配给单个细胞。通过选择5’端接头的通用引物和免疫分子恒定区的巢式引物进行V(D)J富集,可在单个细胞中同时获取TCR/BCR的V(D)J全长序列。在免疫学、自身免疫性疾病和疫苗研究等领域具有广泛的应用前景。
应用方向
肿瘤免疫微环境,助力免疫治疗
研究发现,TCR和BCR通过基因重组以及体细胞突变而呈现多样性,因此可以帮助身体识别和抵御各种入侵者。通过单细胞免疫谱分析,可在单个细胞水平上捕捉肿瘤发生时基因表达变化与全长的、配对的TCR/BCR信息,跟踪免疫微环境的变化,寻找免疫治疗的靶点,辅助免疫治疗。
传染病及疫苗研究
疫苗在预防和治疗传染性病或者某些慢性疾病方面发挥着重要的作用。研究发现,将灭活的T细胞作为疫苗接种后,能够有效的激活机体特异性细胞免疫应答,用于治疗某些自身免疫性疾病。因此,单细胞免疫谱方案可辅助传染性疾病以及疫苗的研究。
自身免疫性疾病和炎性疾病的发生机制
研究发现,抗原特异性B细胞或者T细胞的激活可导致很多自身免疫性疾病和炎性疾病的发生和发展。研究报道,诸如系统性红斑狼疮疾病等自身免疫性疾病的发生和B细胞或者T细胞的活化有关。此外,体内调节性T细胞可通过改变肠道内的细菌类型而引起炎症和自身免疫性疾病。因此,研究单细胞免疫谱可以解析自身免疫性疾病和炎性疾病的发病机制,从而为疾病的诊疗提供依据。
移植和免疫重建
骨髓或器官移植多会诱发宿主发生排斥反应,从而发生慢性移植抗宿主病。其中,T细胞与移植后免疫反应密切相关,可以通过调控T细胞诱导移植免疫耐受。研究表明,T细胞免疫重建是造血干细胞移植成功的关键,而T细胞免疫重建的指标包括T细胞亚群的数量和比例、TCR基因谱系等。因此可以借助单细胞免疫谱方案检测移植后的T细胞库,从而评估移植效果。
技术优势

1. 操作简单

7分钟内完成100-80,000个细胞的分离

2. 捕获效率高

细胞捕获率高达65%

3. 操作简单

细胞大小选择灵活,实验流程简单,检测灵敏度高

4. 应用广泛

可研究免疫细胞的克隆性、多样性和细胞环境

5. 分析专业

强大的分析流程和直观的可视化软件

技术参数

样本类型

新鲜或冷冻细胞系、流式分选细胞、单细胞悬浮液

送样要求

细胞数量:≥1×105

细胞活性:复苏和洗涤后的细胞活性≥75%,无红细胞或其他杂质

推荐检测策略

单细胞免疫谱研究平台:10x Genomics的Chromium平台

测序平台:Illumina HiSeq X TEN或者Illumina NovaSeq 6000

测序策略:PE 150

测序数据量:≥95 Gb(以5000个细胞为例)

服务周期

4个样本以内16个工作日完成所有实验和生物信息分析工作

8个样本以内20个工作日完成所有实验和生物信息分析工作

实验流程

图1 Chromium Single cell 3’ Solution实验流程

图1 Chromium Single Cell Immune Profiling Solution实验流程

基于微流体技术将单个细胞、带有barcode序列和引物序列的凝胶微珠以及逆转录反应体系包裹在油滴中,形成GEMs。随后,细胞裂解,释放mRNA,合成barcode标记的cDNA第一链。GEMs裂解后,利用通用引物扩增全长cDNA序列。接下来,分别构建5’基因表达谱文库和免疫谱文库。其中,免疫谱文库构建是利用V(D)J的引物扩增获得TCR以及BCR序列,回收PCR扩增产物后,对产物进行酶切、末端修复、加A碱基等,完成文库的构建。
生物信息分析流程

图2 生物信息分析流程

重要分析结果展示

图3 克隆型丰度图

(左图为检测样本的克隆型丰度,右图为TCR标准的克隆型丰度)

图4 V-J基因组合热力图

(左图为检测样本中V-J基因热力图,右图为TCR标准的V-J基因热力图)

经典案例解读
乳腺癌微环境中不同免疫表型的单细胞图谱
了解肿瘤微环境中的免疫细胞表型对理解肿瘤进展机制和免疫治疗反应至关重要。作者从8名乳腺癌患者的肿瘤样本及配对的正常组织、血液和淋巴结样本中获得45,000个免疫细胞,并利用inDrop技术对其进行单细胞表达谱测序,而后对这些数据进行了聚类分析和细胞类型鉴定。尽管正常和肿瘤组织固有免疫细胞有显著的相似性,作者观察到肿瘤微环境的表型存在异质性。随后,作者利用10x Genomics公司的单细胞免疫谱方法检测了乳腺癌组织的27,000个T细胞的配对的单细胞表达谱和TCR信息,通过生物信息分析发现TCR表型组合的多样性。这些结果支持在癌症中T细胞持续激活的模型,有助于更好地了解免疫细胞促进和延缓肿瘤生长背后的分子机制。

图5 TCR组库具有不同的表型状态

参考文献
Azizi, E., Carr, A. J., Plitas, G., et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment [J]. Cell, 2018, 174(5):1293-1308.e36.