产品介绍
单细胞表达谱分析能够揭示单个细胞的基因表达情况,有效解决组织样本细胞异质性的问题,是肿瘤细胞异质性、免疫细胞群体以及胚胎发育研究的重要技术。在肿瘤、发育生物学、神经科学等领域发挥至关重要的作用,正成为生命科学研究的焦点。
10x Genomics公司的单细胞基因表达谱解决方案(The Chromium Single Cell Gene Expression Solution)利用微流体技术,通过barcode区分不同细胞,独立分子标签(Unique Molecular Identifier,UMI)区分不同转录本。借助该技术可获得单细胞水平的基因表达信息,从而实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测,有助于发现新的稀有细胞类型,并深入了解细胞生长过程中的表达调控机制。
应用方向
肿瘤细胞异质性研究
近年来,单细胞表达谱分析已成功应用到了肿瘤细胞异质性研究领域,并具有良好的临床应用前景。通过单细胞表达谱可以获得单个肿瘤细胞基因表达信息,从而计算细胞间基因表达的差异,能够更好地明确单个肿瘤细胞在其微环境中的功能。该技术的广泛应用可极大程度地辅助肿瘤的早期诊断、个体化治疗效果的评估。/BCR信息,跟踪免疫微环境的变化,寻找免疫治疗的靶点,辅助免疫治疗。
胚胎发育与细胞分化研究
一个受精卵从单细胞发育、分化为大量不同类型的细胞、组织和器官,最终形成一个完整的生命体。运用单细胞表达谱解决方案对胚胎早期不同生长阶段细胞的基因表达情况进行分析,可以获得细胞分化过程中的基因表达变化和基因调控特征。
免疫细胞异质性研究
病原体的多样性导致了免疫细胞的高度异质性,利用单细胞表达谱解决方案能够解析免疫系统对不同病原体的反应机制。传统的检测方法,取样来自细胞群体,低估了免疫细胞的多样性。而单细胞表达谱解决方案通过分析单个细胞的转录情况,能够更加精确检测单个免疫细胞的遗传物质,从而理解机体复杂的免疫机制。
神经科学研究
大脑中有亿万个神经细胞,这些神经细胞在细胞形态、突触连结、细胞结构、电生理以及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞的基因组、蛋白组、化学分子组成、代谢等,都有着很大的差别。单细胞表达谱解决方案已经用于描绘阿尔茨海默氏症、帕金森病、精神分裂症和双相型障碍等不同脑疾病的细胞起源,有助于更深入地了解大脑神经细胞,揭示疾病的发生发展机制。
技术优势

1. 实验操作简单

无需提前选细胞,无需微量扩增

2. 通量高

9分钟内完成500~80,000个细胞的分选

3. 捕获效率高

细胞捕获高达65%

4. 单细胞水平

每1000个细胞中细胞率低达0.9%

5. 应用范围广

鉴定新靶点、生物标志物、分析细胞类型以及细胞状态等

6. 性价比高

相比较于单细胞平台,操作简单,实验成本低

技术参数

样本类型

新鲜或冷冻细胞系、流式分选细胞、单细胞悬浮液

送样要求

细胞数量:≥1×105

细胞活性:复苏和洗涤后的细胞活性≥75%,无红细胞或其他杂质

推荐检测策略

单细胞表达谱研究平台:10x Genomics的Chromium平台

测序平台:Illumina HiSeq X TEN或者Illumina NovaSeq 6000

测序策略:PE 150

测序数据量:≥40 Gb(以5000个细胞为例)

服务周期

4个样本以内16个工作日完成所有实验和生物信息分析工作

8个样本以内20个工作日完成所有实验和生物信息分析工作

实验流程

图1 Chromium Single cell 3’ Solution实验流程

单细胞表达谱解决方案利用barcode区分不同的细胞,利用UMI区分不同转录本表达量,从而实现单个细胞的基因表达检测。首先,含有独特barcode标记信息的凝胶珠与细胞、酶的混合物形成一个油滴包裹的凝胶珠(Gel Beads-in-emulsion,GEM)。GEM形成后,细胞裂解,凝胶珠自动溶解释放大量barcode序列,随后mRNA逆转录产生带有barcode和UMI信息的cDNA。随后以cDNA为模板进行PCR扩增,然后进行Illumina标准文库构建及3’端测序。
生物信息分析流程

图2 生物信息分析流程

重要分析结果展示

图3 Cell Ranger分析结果图

(绿色代表所要检测的细胞,灰色代表背景细胞)

图4 t-SNE分析结果图

(图中每个点代表一个细胞,不同颜色代表不同的分类)

图5 Seurat软件进行聚类分析(每个点代表一个细胞,不同颜色代表不同的cluster。基于

Mark Gene将不同的cluster用细胞名称标出。由于部分cluster的Marker Gene无法用Cell

Type来代替,所以没有对其进行细胞名称标注)

经典案例解读
单细胞表达谱方案发现肠内分泌谱系细胞具有肠道干细胞活性
作者对肠道干细胞进行单细胞表达谱分析,研究肠道干细胞之间的内在联系。其中,作者发现Bmi1-GFP+和Prox1+细胞为肠内分泌谱系细胞,在体内平衡和损伤诱导的再生过程中具有肠道干细胞活性。首先,作者对流式分选的不同肠道干细胞(Intestinal stem cells, ISCs)群体进行表达谱测序。通过层级聚类分析发现Bmi1-GFP+和mTert-GFP+细胞组成Cluster 2,其中Bmi1-GFP+细胞含有丰富的肠内分泌(enteroendocrine,EE)细胞标记物,包括Prox1基因。同时,作者通过体内实验证明了Prox1+和Bmi1+肠上皮细胞的功能相似。随后,通过对2个批次(共计1051个)的Prox1-GFP+单细胞进行表达谱分析,作者发现Prox1基因与EE和Tuft细胞的标记基因共表达。流式分选并比较分析了1,607个Lgr5-eGFP+细胞,658个隐窝Bmi1-GFP+细胞,246个Prox1-GFP+细胞,1,010个Lgr5-eGFP-单细胞表达谱数据,发现Prox1-GFP+和Bmi1-GFP+细胞一样表达EE细胞标记基因。最后,作者通过SPADE(panning Tree Progression of Density-normalized Events)分析揭示了Prox1-GFP和Bmi1-GFP细胞的发育轨迹。文章运用单细胞表达谱研究干细胞异质性和细胞谱系,并对干细胞标记物进行预测,从而推动肠道再生过程中EE细胞可塑性的研究。

图6 Prox1-GFP+细胞的单细胞表达谱分析

参考文献
Yan, K. S., Gevaert, O., Zheng, G. X. Y., et al. Intestinal Enteroendocrine Lineage Cells Possess Homeostatic and Injury-Inducible Stem Cell Activity [J]. Cell Stem Cell, 2017, 21(1):78-90.e6.