产品介绍
DNA甲基化(DNA Methylation)是指在甲基转移酶的催化下,S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基添加到DNA分子的碱基上的过程。胞嘧啶第5位碳原子和甲基的共价结合是常见的甲基化形式,胞嘧啶被修饰为5甲基胞嘧啶(5mC)。 目前,全基因组甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS)主要是通过重亚硫酸盐(Bisulfite)将基因组中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,然后结合Illumina高通量测序平台,对全基因组范围内胞嘧啶的甲基化水平进行测定,精确分析每一个胞嘧啶的甲基化状态,从而构建全基因组甲基化图谱,进而探究胞嘧啶的甲基化在人类疾病、细胞生长发育过程中的重要机制。
应用方向
癌症
哺乳动物的DNA胞嘧啶甲基化在基因组上广泛分布,而在CpG岛区域较为富集。除了基因组序列的改变,DNA甲基化水平和模式的改变也是肿瘤发生的重要标志。比如肿瘤细胞中,抑癌基因启动子区CpG岛被高度甲基化,抑制了抑癌基因的表达,从而导致肿瘤发生。全面了解癌细胞和癌旁细胞的基因组甲基化水平差异,对于研究癌症发生的分子机制以及寻找癌症早期诊断的分子标记具有重要意义。
胚胎发育
在原生殖细胞和胚胎发育的整个过程中,DNA甲基化模式会发生全基因组范围内的重排。DNA甲基化模式改变能引包括染色体状态改变在内的一系列变化,进而决定细胞分化的方向。维持正常的DNA甲基化模式和甲基化水平,是胚胎正常发育以及组织特异性分化所必需的。通过全基因组甲基化测序,可以构建胚胎发育各阶段的全基因组甲基化图谱,研究DNA甲基化在胚胎发育各阶段中的作用。
技术参数
样本类型
DNA、血液、血浆/血清、唾液、组织、细胞、FFPE
送样要求
样本类型 送样要求
冰冻新鲜组织 新鲜组织≥5mg,立即在液氮中冷冻半小时。-80°C保存,干冰运输。
FFPE组织 3~5张FFPE切片,4~5um,0.6mm3。请提供H&E染片。FFPE切片常温运输。
细胞 细胞量≥5×105 ,收集好的细胞离心后,PBS缓冲液洗两遍,立即在液氮中冷冻半小时。-80°C保存,干冰运输。
血液 总量≥0.5ml,抗凝管:柠檬酸钠管或EDTA管,不建议肝素抗凝管。-80°C保存,干冰运输。
血浆/血清 血浆/血清总量≥2.5ml,抗凝管:柠檬酸钠管或EDTA管,不建议肝素抗凝管。-80°C保存,干冰运输。 血液总量≥7.5ml,抗凝管:柠檬酸钠管或EDTA管,不建议肝素抗凝管。-80°C保存,干冰运输。
唾液 1-2ml
gDNA DNA溶于TE buffer,总量≥300ng,浓度20-100ng/ul,体积≥10μL。
测序平台和数据量
测序平台:Illumina NovaSeq 6000或者Illumina HiSeq X10
测序模式:PE 150
数据量:90G,约30X
服务周期
实验周期
1. 50个样本以内,35个工作日
2. 51-100个样本,60个工作日
3. 超过100个样本,询期
标准生物信息分析周期
1. 20个样本以内,30个工作日
2. 50个样本以内,60个工作日
3. 超过50个样本,询期
实验流程
图1 WGBS实验流程
生物信息分析流程
图2 生物信息分析流程
重要分析结果展示
图3 不同甲基化模式分析
(甲基胞嘧啶包括三种模式:mCG、mCHG和mCHH,其中H代表
A或T或C碱基,图中深蓝色代表mCG,蓝色代表mCHG,浅蓝色代表mCHH)
图4 甲基化位点在基因组上的分布
(蓝色点代表以10 kb为窗口,窗口内甲基化胞嘧啶的密度,黑色矩形
表示近着丝粒位置,字母s、m、e分别代表染色体的开始、中间以及末端)
图5 差异甲基化区域相关基因的GO富集分析
(红色表示生物学功能,绿色表示细胞组成,蓝色表示分子功能)
图6 差异甲基化区域相关基因的KEGG通路分析
经典案例解析
高频肿瘤融合基因对胃印戒细胞癌预后的意义
国际上首个利用全基因组测序数据对胃印戒细胞癌(Signet-ring Cell Carcinoma, SRCC)进行的研究。该研究确定了胃印戒细胞癌的临床特征与基因组特征,发现了与临床诊断/预后指标和化疗耐药显著相关的高频肿瘤特异融合基因(CLDN18-ARHGAP26/6融合基因),确定了有该融合基因的患者无法从基于5’-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)/奥沙利铂(Oxaliplatin)的化疗方式中获益。
基于32个样本的WGS结果,鉴定出了1000多个SNV,16个InDel(931错义突变,63无义突变,27个剪切位点,6个inframe InDels和10个移码InDels)。没有发现具有显著MSI(微卫星不稳定)样本。病例可以被分为含高频突变的和不含高频突变的两种。鉴定出了6个显著突变基因[TP53 (25%), CDH1 (15.6%), PIK3CA (12.5%), ERBB2(6.3%), LCE1F (6.3%), 和OR8J1 (6.3%) ] (图9)。
图9 SRCC关键基因的突变信息
图8 UHRF1和DNMT3A蛋白表达情况
参考文献
Gkountela S, Zhang K X, Shafiq T A, et al. DNA demethylation dynamics in the human prenatal germline[J]. Cell, 2015, 161(6): 1425-1436.