产品介绍
外显子(Exome)是直接参与蛋白质编码的DNA区域。人类基因组约有180,000个外显子,长度大约30Mb。据报道,大多数单基因遗传病致病突变集中在外显子区。全基因组外显子组测序(Whole Exome Sequencing,WES)是一种利用序列捕获技术将外显子区域及重要调控功能的非转录区域(Untranslated Regions)捕获并富集后进行高通量基因测序的方法。WES可以更为精确地找到与疾病相关的突变位点,具有经济实惠、性价比高的特点。
应用方向
单基因遗传病
寻找单基因遗传病的致病位点是全外显子测序最主要的应用之一。目前,全外显子组测序已经在米勒综合症、歌舞伎综合症、重型颅脑畸形等多种单基因遗传疾病的研究中得到了成功应用。
复杂性疾病
对于癌症和复杂性疾病,全外显子组测序也可观察到高度相关的遗传突变。针对极低频率的致病突变因测序深度不足而丢失的问题,高深度的全外显子测序可以很好地克服这一问题,这对探究复杂性疾病的发病机理有着重要的意义。
癌症
癌症基因组中的全外显子区域的突变最有可能影响肿瘤的发生发展,通过全外显子测序准确地检测SNV及InDel,可高效地解析癌症易感和致病基因,为癌症基因组研究提供了可靠的方法。全外显子组测序已成为许多肿瘤-正常样本比较的首选方法。
技术参数
样本类型
DNA、血液、血浆/血清、唾液、组织、细胞、FFPE
送样要求
样本类型 送样要求
冰冻新鲜组织 新鲜组织≥5mg,立即在液氮中冷冻半小时。-80°C保存,干冰运输。
FFPE组织 3~5张FFPE切片,4~5um,0.6mm3。请提供H&E染片。FFPE切片常温运输。
细胞 细胞量≥5×105 ,收集好的细胞离心后,PBS缓冲液洗两遍,立即在液氮中冷冻半小时。-80°C保存,干冰运输。
血液 总量≥0.5ml,抗凝管:柠檬酸钠管或EDTA管,不建议肝素抗凝管。-80°C保存,干冰运输。
血浆/血清 血浆/血清总量≥2.5ml,抗凝管:柠檬酸钠管或EDTA管,不建议肝素抗凝管。-80°C保存,干冰运输。 血液总量≥7.5ml,抗凝管:柠檬酸钠管或EDTA管,不建议肝素抗凝管。-80°C保存,干冰运输。
唾液 1-2ml
gDNA DNA溶于TE buffer,总量≥300ng,浓度20-100ng/ul,体积≥10μL。
测序平台和数据量
测序平台:Illumina NovaSeq 6000或者Illumina HiSeq X10
测序模式:PE 150
疾病 建议测序深度 建议测序量
单基因遗传病和复杂性疾病 有效测序深度100X a.Agilent SureSelect V6≥13G
b.Agilent SureSelect V5≥10G
肿瘤 肿瘤样本达到有效测序深度200X,
正常样本达到有效深度100X
a.Agilent SureSelect V6 肿瘤样本≥26G,正常样本≥13G
b.Agilent SureSelect V5 肿瘤样本≥20G,正常样本≥10G
注:要求肿瘤样本中肿瘤细胞含量超过60%。
测序平台和数据量
推荐使用Agilent SureSelect All Human Exome V5(50Mb)或Agilent SureSelect All Human Exome V6(60Mb)外显子捕获试剂盒
(注:如需其他外显子组捕获试剂盒,请联系明码生物科技市场部或当地销售)
服务周期
实验周期
1. 100个样本以内,15个自然日
2. 101-200个样本,20个自然日
3. 超过200个样本,询期
标准生物信息分析周期
1. 20个样本以内,10工作日
2. 50个样本以内,15个工作日
3. 100个样本以内,20个工作日
4. 超过100个样本,询期
实验流程
图1 Agilent SureSelect Human All Exon捕获及测序流程
生物信息分析流程
图2.1 Sentieon 单样本分析流程
图2.2 Sentieon joint call家系分析流程
图2.3 Sentieon TN-seq生物信息分析流程
重要分析结果展示
图3 高频显著突变基因突变图谱(Oncoplot)
图4 核苷酸变异频率热图
(x轴代表变异类型,y轴代表样本名称和聚类结果,颜色越深表示频率越大)
图5 SNV突变标签分析
(x轴代表核苷酸变异类型,y轴代表突变频率)
经典案例解析
针对113例肝内胆管癌的全外显子组测序寻找体细胞突变图谱
研究人员对113例肝内胆管癌患者的癌组织和癌旁组织配对样品进行了全外显子测序,共发现9197个非沉默突变,2825个沉默突变,平均每个肿瘤样本存在81个非沉默突变(图6a)。共有70个基因存在非沉默突变,它们参与了细胞周期,细胞凋亡以及DNA损伤相关等重要代谢通路(图6b)。99%的癌组织存在与细胞周期相关的突变位点,93%的患者TP53基因上发生了变异,因此说明TP53与肝内胆管癌发生和转移密切相关。另外,组蛋白修饰相关基因(KMT2D、MLL2、EP300、CREBBP等)的突变频率相对较高,其中EP300基因突变会明显降低癌症患者的存活率(图7)。值得一提的是,本研究的生物信息分析内容由明码生物科技提供。
图6 体细胞突变统计结果
图7 发生在组蛋白修饰基因的遗传突变
参考文献
Zou, S., J. Li, H. Zhou, et al., Mutational landscape of intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Nat Commun, 2014. 5: 5696.